Alleviation of oxidative stress and detoxification ol lipid peroxidation products by flavin-dependent oxidoreductases in plants

Kurzbeschreibung

Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Membranlipide werden leicht durch reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) oxidiert. Dadurch entstehen als Lipidperoxidationsprodukte Aldehyde und Ketone, deren Akkumulation die Pflanzenzelle stark schädigen. In dieser Arbeit werden zwei Vertreter einer Enzymfamilie untersucht, die möglicherweise maßgeblich an der Entgiftung der reaktiven Carbonylgruppe dieser Oxidationsprodukte beteiligt sind und als 12-Oxophytodiensäure Reduktasen (OPRs) bezeichnet werden. Die Mitglieder dieser kleinen Enzymfamilie sind flavinabhängige Oxidoreduktasen, welche Homologe des Old Yellow Enzyme der Hefe sind, mit sechs Vertretern in A. thaliana. Der Name ist abgeleitet von OPR3, das die Reduktion der Oxophytodiensäure katalysiert, welches ein zentraler Schritt in der Biosynthese der Jasmonsäure ist. Es ist jedoch wenig über die physiologische Bedeutung der anderen OPR Enzyme bekannt. Die Charakterisierung von "Loss-of-function"-Mutanten von AtOPR1, 2 und 4 zeigte eine verminderte Toleranz gegen photooxidativen Stress. Diese Enzyme scheinen eine Schutzfunktion durch Entgiftung von Lipidperoxidationsprodukten zu haben. Die AtOPR5 und AtOPR6 Mutanten zeigten jedoch keinen Phänotyp, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass die beiden Gene in Promotor und kodierender Region identisch sind und identische Transkripte liefern.

Um die Funktion der AtOPR5/6 Gene in pflanzlichen Stress-Antworten zu untersuchen, wurde als Strategie die RNA-Interferenz gewählt, um beide Gene gemeinsam herunterzuregulieren. Die AtOPR5/6-RNAi-Pflanzen zeigten eine starke Intoleranz gegenüber Starklichstress, was sich in einer reduzierten Effizienz der Photochemie am Photosystem II und Photoinhibierung äußerte. Dieser Phänotyp ist vergleichbar mit Pflanzen, die einen Defekt in der Entgiftung reaktiver Carbonyle aufweisen und stellt damit einen Hinweis auf eine ähnliche Funktion für OPR5/6 dar. Darüber hinaus wird diese Rolle durch eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Methylvinylketon (MVK), einem Lipidperoxidationsprodukt, unterstützt. Die MVK behandelten opr1 und opr2 Mutanten, sowie die AtOPR5/6-RNAi-Pflanzen zeigten einen signifikant verstärkten Zelltod im Vergleich zum Wildtyp.

Um den Entgiftungsprozess genauer zu untersuchen, musste AtOPR5/6 in ausreichenden Mengen aufgereinigt werden. Die Bedingungen zur Expression und Aufreinigung wurden optimiert, da AtOPR5/6 zur Aggregation tendierte und in unlöslicher Form als "inclusion bodies" akkumulierte. Schließlich erwies sich die Denaturierung und spätere Rückfaltung als effizienteste Strategie, um eine ausreichende Menge an stabilem und löslichem OPR5/6 Protein zu generieren. Allerdings konnte für AtOPR5/6 keine katalytische Aktivität gezeigt werden. Dies könnte durch eine besondere Substratspezifität oder eine inaktive Proteinkonformation zu erklären sein.

Die ähnlichen Starklicht-empfindlichen Phänotypen von opr1, 2, und 4 Einzelmutanten und AtOPR5/6-RNAi-Pflanzen deuten darauf hin, dass diese Gene auf nicht redundante Weise zur Stressakklimation beitragen. Frühere Studien wiesen unterschiedliche gewebespezifische Expressionsmuster für AtOPR1, 2, und 4 nach, worauf ihre nicht redundante Wirkung zurückzuführen sein mag. In dieser Arbeit wurden transgene Pflanzen untersucht, die das ?-Glucuronidase (GUS) Reportergen unter der Kontrolle des AtOPR5/6 Promotors exprimieren. Die AtOPR5/6 Promotoraktivität unterschied sich von der anderer AtOPRs und war besonders hoch im Hypokotyl und den ausgewachsenen Blättern der Rosette, nicht aber in etiolierten Keimlingen, den Reproduktionsorganen und der Wurzel. Weiterhin zeigte eine Untersuchung der subzellulären Lokalisation von AtOPR5/6 eine Lokalisation im Golgi Apparat. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die unterschiedlichen OPRs eine sich gegenseitig ergänzende Rolle im Entgiftungsprozess spielen, um die zelluläre Homöostase von Stressmetaboliten in verschiedenen Pflanzengeweben und verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu kontrollieren.