Versuch zur Bestimmung des ATP-Gehalts von HeLa-Zellen mittels einer Lumineszenz-Assays

Praktikumsbericht / -arbeit aus dem Jahr 2016 im Fachbereich Chemie - Biochemie, Note: 0,0, Ruhr-Universität Bochum (Fakultät für Chemie und Biochemie), Veranstaltung: Lehrstuhl für Biochemie II Biochemisches Grundpraktikum für Chemiker, Sprache: Deutsch, Abstract: Bei dem Versuch F-14 wird der ATP-Gehalt von HeLa-Zellen mittels Lumineszenz-Assay bestimmt. Dazu wird zunächst eine ATP-Standarisierungskurve angelegt, damit in der Auswertung die Menge ATP in den Zellen bestimmt werden kann. Dazu wird eine Konzentrationsreihe an ATP erstellt. Im nächsten Schritt wird das Zellysat hergestellt, in dem der ATP-Gehalt bestimmt werden soll. Dazu werden die Zellen zentrifugiert und in Schwellpuffer resuspendiert. Nach weiterer Zentrifugation und Abdekantieren erfolgt ein mechanischer Aufschluss der Zellen im Douncer. Im letzten Schritt werden die Zellkerne und Zelltrümmer mittels Zentrifugation getrennt. Weiterhin wird die Kinetik des ATP-Abbaus in dem Zellysat ermittelt. Dazu wurde das Zellysat zunächst inkubiert und anschließend ein Aliquot der Probe in unterschiedlichen Zeitetappen mit Kochpuffer versetzt und weitere fünf Minuten bei 95 °C inkubiert, um den Abbau des ATPs im Zellysat zu stoppen. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand zur Messung abgenommen.
Im weiteren Verlauf des Versuches erfolgt eine Standardisierung der Proteinmenge mittels Bradford-Assay. Da für den Aufschluss der HeLa-Zellen Douncer verwendet werden, muss eine Standardisierung erfolgen. Die Douncer "haben leicht unterschiedliche Maße, sodass der Prozentsatz an aufgeschlossenen Zellen je nach verwendetem Douncer variiert"(Skript). Durch die Äquivalenz ergibt sich dann auch, dass das hergestellte Zellysat unterschiedliche Mengen an Protein enthält und dementsprechend auch an ATP. Damit ein Vergleich möglich ist, muss die Menge an detektiertem ATP in einem Bezug zur Menge an Proteinen im Zellysat stehen. Der Zusammenhang wird durch das Bradford-Assay gewährleistet, womit dann auch die Proteinmenge bestimmt werden kann. Zunächst wird eine Standardisierungskurve des Bradford-Assays erstellt. Dazu wird eine lineare Verdünnungsreihe des Proteins BSA angelegt und die OD bei 595 nm bestimmt.
Im letzten Schritt des Versuchs wird die Kinetik des ATP-Abbaus mittels Luciferase-Assays analysiert. Dazu werden die zuvor angefertigten ATP-Lösungen und die Proben des denaturierten Zellysates in eine Mikrotiterplatte vorgelegt und jeweils mit dem Luciferin/Luciferase-Reagenz versetzt. Die Auswertung erfolgt über den Luminometer.